免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。這是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是:當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí),完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用就被保留了下來(lái)。假如用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。目前多用精制的proreinA預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后,beads上的proreinA就可以吸附抗原達(dá)到精制的目的。這樣的方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合;也可用來(lái)確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
COIP免疫共沉淀的優(yōu)點(diǎn)
其優(yōu)點(diǎn)為:(1)相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的,處于天然狀態(tài);(2)蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的,可以避免人為的影響;(3)可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)為:(1)可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用;(2)兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合,而可能有第三者在中間起橋梁作用;(3)必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么,以選擇最后檢測(cè)的抗體,所以,若預(yù)測(cè)不正確,實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果,方法本身具有冒險(xiǎn)性。
COIP免疫共沉淀注意事項(xiàng)
(1)細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用,
多采用非離子變性劑(NP40 或Triton X-100)。 每種細(xì)胞的裂解條件是不一-樣的,通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS), 細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑,如商品化的
cocktailer。
(2)確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白,單克隆抗
體的使用有助于避免污染的發(fā)生;.
(3)要確??贵w的特異性,即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀;
(4)確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中,而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的,這需要進(jìn)
行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。
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