迄今為止，文獻(xiàn)報(bào)道的許多類器官都是在Matrigel中培養(yǎng)的。Matrigel來源于Engelbreth Holm-Swarm小鼠肉瘤細(xì)胞的分泌物，制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，在3D細(xì)胞培養(yǎng)中得到了廣泛的應(yīng)用。而蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，Matrigel含有1800多種蛋白質(zhì)，——由此可以看出，Matrigel成分復(fù)雜，這大大加劇了類器官結(jié)構(gòu)和功能研究的難度。此外，Matrigel的批次不穩(wěn)定也使類器官實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性大打折扣。與此同時(shí)，出于免疫原性的考慮，動(dòng)物來源的Matrigel在疾病建模和臨床研究中的應(yīng)用也受到了限制。基于上述原因，對(duì)既能滿足類器官培養(yǎng)要求、又能滿足臨床研究要求的新型基質(zhì)的需求越來越多。而無異源基質(zhì)膠正是滿足這些要求的理想選擇。

無異源基質(zhì)膠是由溶解的人源組織制備的細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠（ECM）。在制備過程中，保留了天然組織的部分生物學(xué)活性，促進(jìn)了其中培養(yǎng)的類器官的結(jié)構(gòu)和功能重塑。此外，這類水凝膠保留了細(xì)胞外微環(huán)境的組織特異性，相比Matrigel，可以更好支持各種組織來源細(xì)胞的生長(zhǎng)；其源于人源組織的特性，也大大減少了臨床應(yīng)用中的免疫原性問題。無異源基質(zhì)膠的這些優(yōu)點(diǎn)，使其具有重要的臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而大大推動(dòng)再生醫(yī)學(xué)技術(shù)和組織工程的進(jìn)步。

人源ECM的凝膠化和表征

首先驗(yàn)證HumaMatrix（一種源自人源的細(xì)胞外基質(zhì)）在遵循凝膠化方案時(shí)可以成功地制備成水凝膠，首先用HCl 溶液溶解HumaMatrix粉末，用NaOH調(diào)節(jié)pH 至中性，靜置到接近生理溫度。實(shí)驗(yàn)組的人源 ECM 水凝膠在不同濃度（3、4、5、6、7 和 8 mg/mL）下都制備成水凝膠；用三個(gè)批次的HumaMatrix在8 mg/mL的濃度下，約 30 分鐘都制備成水凝膠。

圖1. 不同濃度的人源ECM形成水凝膠

其次，去細(xì)胞化和凝膠化的處理方法，有效保留了人源ECM成分，如膠原蛋白、彈性蛋白，且仍含有糖胺聚糖。與傳統(tǒng)3D培養(yǎng)系統(tǒng)（例如Matrigel）相比，人源ECM基質(zhì)膠所含成份和三維結(jié)構(gòu)明顯不同。為進(jìn)一步研究HumaMatrix的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行掃描電鏡分析。

圖2. 顯示HumaMatrix的掃描電鏡 (SEM) 圖像

人源ECM對(duì)血管生成的影響

血管生成的測(cè)定。根據(jù)體外血管生成測(cè)定的歷史金標(biāo)準(zhǔn)方法，我們比較了分別用Matrigel和hPM（一種源自胎盤的人類細(xì)胞外基質(zhì)）誘導(dǎo)的微血管網(wǎng)絡(luò)（圖 3C）。首先將EC培養(yǎng)物用Matrigel或hPM來培養(yǎng)，然后使用Calcein AM檢測(cè)以確定活性和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)1天后，Matrigel包被的孔板上顯示HUVEC形成明確的血管生成小管網(wǎng)絡(luò)，但在 3 天后，相同的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)塌陷成凋亡細(xì)胞的球形球（圖3A、3C）。雖然在hPM誘導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)一些細(xì)胞死亡，且在延長(zhǎng)培養(yǎng)5天后沒有觀察到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。在血管生成的晚期，EC募集平滑肌細(xì)胞 (SMC) 以穩(wěn)定生長(zhǎng)的微血管。按照同樣的方法評(píng)估了hPM和Matrigel對(duì)平滑肌細(xì)胞形態(tài)的影響。有趣的是，在沒有HUVEC的情況下，接種到Matrigel上的SMC在1天后形成小管，但在hPM涂層板上，SMC保持典型的“山丘和山谷"形狀（圖 3D），表明細(xì)胞類型之間的分子信號(hào)通路存在顯著差異 【1】 。

圖3. 在hPM 和 Matrigel 包被的組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的體外血管生成網(wǎng)絡(luò)【1】

人源ECM支持hiPSC三系分化

hiPSCs 來源于多種類型的人原代細(xì)胞，包括新生兒包皮成纖維細(xì)胞、成人真皮成纖維細(xì)胞和成人成骨細(xì)胞。在多譜系分化之前，使用Tra-1-81對(duì)未分化的人多能干細(xì)胞進(jìn)行ICC（圖 4a）。如圖所示，hiPSCs批次顯示Tra-1-81的清晰表達(dá)。hiPSC 分為三個(gè)階段以分化出目標(biāo)譜系（圖 4b）。在EB形成期間，hiPSC先轉(zhuǎn)化為特定的譜系；在第二階段，EB在各種基質(zhì)上發(fā)生了附著、生長(zhǎng)和成熟；最終，細(xì)胞在第三階段成熟和擴(kuò)增以完成向目標(biāo)譜系的分化【2】。

圖4. hiPSC 細(xì)胞系的表征和分化示意圖【2】

人源ECM用于藥物篩選

hPM除了應(yīng)用在再生醫(yī)學(xué)中，還能用于體外篩選血管生成相關(guān)藥物【1】。同時(shí)也測(cè)試了HumaMatrix培養(yǎng)的腸癌類器官篩選相關(guān)藥物的能力，Matrigel已被廣泛用作體外篩選抗血管生成癌癥藥物的模型和癌癥類器官模型，因此用Matrigel作為對(duì)照。圖5通過比較用TSP-1處理的Matrigel或hPM培養(yǎng)的EC（內(nèi)皮細(xì)胞）生長(zhǎng)情況來評(píng)估藥物對(duì)血管生成的抑制作用。其中，TSP-1是一種對(duì)血管生成和新血管形成有抑制活性的糖蛋白，是實(shí)體瘤抗血管生成治療的常規(guī)用藥【1】。我們?cè)O(shè)計(jì)類似實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HumaMatrix培養(yǎng)的腸癌類器官在藥物篩選中的表現(xiàn)。通過比較Matrigel或HumaMatrix培養(yǎng)的腸癌類器官經(jīng)過不同濃度的Regorafenib處理后的生長(zhǎng)狀況，評(píng)估類器官對(duì)不同藥物的敏感性（如圖6）。

圖5. 使用基于hPM的血管生成實(shí)驗(yàn)來篩選抗血管生成腫瘤抑制蛋白TSP-1【1】

圖6. 使用不同濃度的Regorafenib處理腸癌類器官來檢測(cè)類器官對(duì)藥物的敏感性。

人源ECM的組織相容性

當(dāng)皮下注射到SD大鼠體內(nèi)，在生理pH條件下，hPM就會(huì)形成水凝膠。注射后20分鐘內(nèi)，在注射位點(diǎn)皮膚下方會(huì)出現(xiàn)一個(gè)腫塊。注射hPM的SD大鼠沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，例如紅斑腫脹和積液。注射后1周對(duì)植入物的組織學(xué)評(píng)估顯示，在所有注射hPM的動(dòng)物中，細(xì)胞浸潤(rùn)反應(yīng)增加。同時(shí)，觀察到輕微的單核細(xì)胞浸潤(rùn)反應(yīng)，主要表明淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的參與（圖7A-F）。此外，還觀察到梭形細(xì)胞，這說明可能有成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)。H&E染色顯示皮下植入物周圍的炎癥反應(yīng)消退，4周后未發(fā)生肉芽腫，表明所有水凝膠均未引起明顯的局部毒性，并顯示出良好的組織相容性【3】。

圖7. HE染色顯示，在大鼠皮下植入后 1、2 和 4 周，組織對(duì)hPM (A-C) 和膠原蛋白I水凝膠(D-F) 的反應(yīng)的組織學(xué)表現(xiàn)。比例尺=200 μm【3】

總結(jié)

小鼠腫瘤細(xì)胞衍生的 Matrigel方便購買且易于使用，支持類器官生長(zhǎng)和擴(kuò)增。然而，Matrigel的來源限制了類器官在細(xì)胞治療或組織工程應(yīng)用中的直接臨床轉(zhuǎn)化。顯然需要一種根據(jù)GMP指南生產(chǎn)的水凝膠替代品。這種替代方案還必須保證類器官的培養(yǎng)和大規(guī)模擴(kuò)增。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，人源ECM水凝膠是用于大規(guī)模培養(yǎng)類器官的潛在選擇，可能釋放類器官的巨大臨床潛力，推動(dòng)臨床研究中血管生成技術(shù)的進(jìn)步。

參考文獻(xiàn)

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