真假胎牛血清及擇取胎牛血清質(zhì)量區(qū)別
近日，實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞培養(yǎng)人員抱怨培養(yǎng)瓶中在顯微鏡的觀察下有若干“小蠕蟲(chóng)”爬動(dòng)，創(chuàng)凌生物提示您，這是黑膠蟲(chóng)，可以說(shuō)，這樣的細(xì)胞培養(yǎng)瓶可以說(shuō)廢棄了，連二次實(shí)驗(yàn)的價(jià)值都沒(méi)，話說(shuō)黑膠蟲(chóng)難道是實(shí)驗(yàn)室的操作不當(dāng)，如添加細(xì)胞因子，小分子化合物等中出現(xiàn)了人為的環(huán)境污染？不是的，黑膠蟲(chóng)產(chǎn)生的致命原因是假的胎牛血清導(dǎo)致！
據(jù)病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內(nèi)的一種原蟲(chóng)，似乎和草履蟲(chóng)和變形蟲(chóng)有類似之處，然而由于課題經(jīng)費(fèi)不夠而不能繼續(xù)進(jìn)行下去。
在細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)候，有時(shí)會(huì)在400倍顯微鏡下看到小黑點(diǎn)在動(dòng)，小黑點(diǎn)有時(shí)呈點(diǎn)狀，有時(shí)呈小的片狀，運(yùn)動(dòng)形式為在原地振動(dòng)（類似布朗運(yùn)動(dòng)），這種小黑點(diǎn)既不是細(xì)菌、霉菌，也不是支原體（我們?cè)?jīng)請(qǐng)周守長(zhǎng)用血平板培養(yǎng)過(guò)，沒(méi)有菌落出現(xiàn)），目前業(yè)內(nèi)人士稱其為“黑膠蟲(chóng)”。
國(guó)內(nèi)的血清中，通常滅活之后都會(huì)有絮狀沉淀出現(xiàn)，而黑膠蟲(chóng)出現(xiàn)時(shí)，所使用的血清被反復(fù)凍融過(guò)多次。所以推測(cè)，所謂的“黑膠蟲(chóng)”其實(shí)就是血清中的某些蛋白成分的物質(zhì)，經(jīng)過(guò)滅活之后喪失活性，在培養(yǎng)基中，鏡檢見(jiàn)到的運(yùn)動(dòng)其實(shí)是這些物質(zhì)在溶液中做“布朗運(yùn)動(dòng)”。隨著細(xì)胞消耗培養(yǎng)基，這些物質(zhì)越來(lái)越多，*后細(xì)胞所用的營(yíng)養(yǎng)消耗完，細(xì)胞容易死亡。
市場(chǎng)上的胎牛血清種類繁多，魚(yú)龍混雜，很多科研工作者，特別是剛接觸細(xì)胞培養(yǎng)的人，難以分辨血清質(zhì)量的優(yōu)劣，假的胎牛血清，導(dǎo)致黑膠蟲(chóng)的現(xiàn)象越明顯，總結(jié)如下：
一、外觀
拿到血清，*先接觸的是血清外觀，對(duì)于缺少細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)的人來(lái)說(shuō)，外觀的判斷尤為重要
1、顏色
根據(jù)血紅蛋白含量的不同，胎牛血清可表現(xiàn)出黃色或紅色，我國(guó)的細(xì)胞培養(yǎng)用血清標(biāo)準(zhǔn)是不高于20mg/dl，實(shí)際上，血紅蛋白含量的高低對(duì)血清并無(wú)直接影響，這個(gè)指標(biāo)的意義在于能體現(xiàn)出采血過(guò)程的嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范程度，良好的操作能降低血清的溶血。
國(guó)產(chǎn)血清的采血點(diǎn)很分散，大多是由屠戶采血后馬上離心收集，所以很少會(huì)有溶血，表現(xiàn)出明亮的蠟黃色，當(dāng)然，國(guó)產(chǎn)血清也很少有標(biāo)準(zhǔn)意義上的胎牛血清。
進(jìn)口胎牛血清或多或少總有點(diǎn)溶血，因?yàn)檎嬲奶ヅＱ迥δ懿?，紅細(xì)胞容易破裂。
總的來(lái)說(shuō)，國(guó)產(chǎn)的血清呈現(xiàn)出蠟黃。進(jìn)口的血清，質(zhì)量的呈現(xiàn)出談黃、微紅色，如Gibco 16000，差點(diǎn)的呈現(xiàn)出橘紅色或鮮紅色。當(dāng)然，熱滅活血清或保存不當(dāng)?shù)难?，由于血紅蛋白的破壞氧化，會(huì)呈現(xiàn)出暗紅，甚至咖啡色。
2、沉淀
很多血清客戶，會(huì)發(fā)現(xiàn)進(jìn)口血清有沉淀，從而懷疑血清的質(zhì)量問(wèn)題，這是沒(méi)有根據(jù)的。
血清中的沉淀是由纖維蛋白的凝聚產(chǎn)生，對(duì)血清質(zhì)量沒(méi)有任何影響，沉淀的產(chǎn)生原因很多，和廠家的加工生產(chǎn)方式密切相關(guān)。
國(guó)產(chǎn)的血清，大多來(lái)自北方，由于價(jià)格低廉，保存環(huán)境都不好，從采血、冷凍、運(yùn)輸?shù)缴a(chǎn)會(huì)經(jīng)過(guò)多次凍融，每次凍融過(guò)程，就會(huì)析出部分纖維蛋白沉淀，這樣，血清成品過(guò)濾后看起來(lái)反而更加的“干凈”，很少有沉淀產(chǎn)生。
進(jìn)口的胎牛血清，過(guò)濾分裝前很少會(huì)反復(fù)凍融，生產(chǎn)后的成品也是清澈的，但隨著時(shí)間的推移，血清中的大量纖維蛋白會(huì)析出形成沉淀。當(dāng)然，進(jìn)口的新生牛血清，一般牛齡都在2周左右，血清中的各種蛋白含量明顯偏高，生產(chǎn)后血清可能會(huì)渾濁，甚至有大量沉淀。
當(dāng)然，購(gòu)買回來(lái)的血清都是冰凍狀態(tài)，使用時(shí)需要融化，融化過(guò)程在溫度較低的狀態(tài)下慢慢進(jìn)行，否則沉淀相對(duì)較多，雖然沉淀并不直接影響血清的質(zhì)量，但對(duì)細(xì)胞的顯微觀察有一定的阻礙。
3、澄清度
進(jìn)口胎牛血清由于蛋白和脂類等物質(zhì)含量低，表現(xiàn)為稀薄、清淡，而國(guó)產(chǎn)血清，因?yàn)榻^大多數(shù)是新生牛血清，相對(duì)而言更加粘稠，顏色略深，這對(duì)于初步接觸血清的人很難判斷，但把兩者進(jìn)行對(duì)比，可容易分辨。
二、主要技術(shù)指標(biāo)
目前國(guó)內(nèi)血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是2005版的《中華人民共和國(guó)藥典》，主要指標(biāo)有以下幾點(diǎn)：
1、內(nèi)毒素
標(biāo)準(zhǔn)為不高于5EU/ml。內(nèi)毒素是細(xì)菌破碎后細(xì)胞壁的成分，因此內(nèi)毒素含量的高低可表現(xiàn)出采血到生產(chǎn)一系列過(guò)程中的無(wú)菌操作情況。目前，國(guó)產(chǎn)血清基本都能達(dá)到這一要求，很多進(jìn)口胎牛血清內(nèi)毒素含量反而更高，如Gibco 26140，只要求不高于50EU/ml，高出我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)10倍，即使是16000，也要10EU/ml，血清質(zhì)量也未見(jiàn)影響。可見(jiàn)，內(nèi)毒素含量偏高不影響質(zhì)量，除非含量*，預(yù)示著已經(jīng)污染。
2、總蛋白含量
胎牛血清一般范圍是30-40mg/ml，數(shù)值偏高，說(shuō)明采血的牛齡偏大，不是胎牛，數(shù)值偏低，表明血清可能摻水了。
3、血紅蛋白
標(biāo)準(zhǔn)為不高于20mg/dl，顏色越紅，數(shù)值越高，反之，數(shù)值越低。
4、pH
國(guó)產(chǎn)血清，大多高于7.5，進(jìn)口胎牛血清，大多低于7.5，具體原因未知，可能和牛齡有關(guān)，這也能用來(lái)初步鑒別血清的來(lái)源。
5、微生物
包括細(xì)菌、霉菌、支原體、噬菌體、各類病原性病毒等。隨著國(guó)內(nèi)血清廠家生產(chǎn)條件的改善提高，細(xì)菌、霉菌等“大型”微生物幾乎能100%控制，支原體經(jīng)過(guò)0.1um過(guò)濾，大多也能清除。大腸桿菌噬菌體的污染還是比較嚴(yán)重的，主要是生產(chǎn)環(huán)境過(guò)程中帶入，又無(wú)法過(guò)濾，很難*清除，但對(duì)血清質(zhì)量影響不大。病原性病毒，特別是BVDV，在國(guó)產(chǎn)血清中幾乎90%以上都存在，這類微生物是影響國(guó)產(chǎn)血清質(zhì)量的重要因素，而進(jìn)口胎牛血清中基本都控制的很好。
6、免疫球蛋白
國(guó)產(chǎn)血清的只是定性檢測(cè)，結(jié)果也很不準(zhǔn)確，進(jìn)口胎牛血清大多定量檢測(cè)。免疫球蛋白的數(shù)值能*體現(xiàn)出采血的時(shí)的牛齡情況，國(guó)產(chǎn)血清，基本都是新生牛的，血清中容易產(chǎn)生IgM，IgG的含量也偏高，進(jìn)口胎牛血清，不含IgM，IgG的含量也較低。
7、其它
不管是國(guó)產(chǎn)還是進(jìn)口血清，都是不測(cè)抗生素的（無(wú)四環(huán)素胎牛血清除外）。國(guó)外，抗生素的使用很嚴(yán)格，用量也很少，每頭奶牛的產(chǎn)品包括血清都可以溯源的，因此可以做到胎牛血清中不含抗生素或含量極低；國(guó)內(nèi)，抗生素的濫用已成了普遍現(xiàn)象，血清中殘留很高，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)極為不利，這是國(guó)產(chǎn)血清質(zhì)量差的根本原因。
三、血源
市場(chǎng)上的血清血源主要分為中國(guó)、北美、南美和澳洲。
1、國(guó)產(chǎn)血清質(zhì)量差，這是*的，主要原因并不是生產(chǎn)廠家的責(zé)任，而是天然環(huán)境差和抗生素的大量使用。國(guó)內(nèi)環(huán)境污染嚴(yán)重，同時(shí)飼養(yǎng)過(guò)程中抗生素極其濫用，有毒有害物質(zhì)會(huì)大量殘留在血清中，*終不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。
2、南美血清，來(lái)源很多，如Bioind的以色列巴拿馬(04-001-1A/B，04-121-1A/B，04-001AUS-1A/B，04-002-1A/B，04-222-1A/B，04-011-1A/B，04-201-1A/B，04-400-1A/B) 、Gibco的烏拉圭、巴西等，這些血清由于采血的不可控性，質(zhì)量參差不齊，當(dāng)然，相對(duì)于國(guó)內(nèi)血清來(lái)說(shuō)好的多。另外，國(guó)內(nèi)銷售的南美血清大多顏色鮮紅，如Bioind、Gibco、Hylone等品牌，但阿根廷的血清例外，這可能和各國(guó)的采血、生產(chǎn)工藝有關(guān)。
3、北美血清，主要來(lái)自美國(guó)和加拿大，如Hclone的SH30396、SH30070、SH30071、Gibco的16000-044、26140-079等。這類血清，等級(jí)越高的顏色越淡，表現(xiàn)為淡黃中帶一點(diǎn)微紅，SH30070和SH30396對(duì)比就很明顯，特級(jí)胎牛血清基本就能進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)。北美血清還有一個(gè)顯著特點(diǎn)就是每瓶血清都能溯源，這對(duì)一些大型的疫苗廠、藥廠尤為重要。
4、澳洲血清，來(lái)源主要是新西蘭和澳大利亞，這是在北美血清禁運(yùn)之后進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)的，一般不具有溯源功能，由于生產(chǎn)、運(yùn)輸?shù)仍?，價(jià)格相對(duì)來(lái)說(shuō)比較貴。拿Gibco的10099和16000相比較，后者質(zhì)量等級(jí)更高，顏色更淡，性價(jià)比更高。
